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内毒素污染及检测方法(试剂)

2022-04-13
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内毒素,又称脂多糖(LPS),是革兰氏阴性细菌的主要细胞壁成份。内毒素的来源包括培养基、血清、水、缓冲溶液和其他细胞培养试剂,如胰蛋白酶。内毒素是体内外炎症反应的有效诱导剂。内毒素污染是细胞培养和生产注射药物中的主要问题。溶液和试剂可能是无菌但仍含有细菌成分,因此监测细胞培养试剂中是否存在内毒素至关重要。


内毒素污染及检测方法(试剂)

内毒素的特点:

• 3 - 40 kDa:取决于O抗原的大小

• 两亲性:>1000 kDa 会在水溶液中形成聚集物

• 抗紫外线和热稳定性 (最高180°C)

• 多糖:大小因细菌种类而异。在人体诱导特异性抗原反应。

• 脂质A:具有LPS毒性。刺激哺乳动物免疫系统。


内毒素的污染源:

1.水

使用高纯度水制备培养基和溶液,清洁玻璃器皿。

2.玻璃器皿

为了消除内毒素,必须将玻璃器皿加热至250°C(≥30分钟),或加热到180°C(3 小时)。

3.培养液、血清和添加剂

使用前要求制造商提供内毒素水平认证或测试。

4.塑料容器

要求制造商提供内毒素水平和无致热源的证明。


体外和体内实验的风险

内毒素污染及检测方法(试剂)

内毒素在体外和体内实验均可引起不稳定性。脂质A能够激活细胞表面或内体的Toll样受体4(TLR4),诱导MAP激酶(MAPK)及IRF(干扰素调节因子)通路的激活20, 21。尽管内毒素的作用随浓度和细胞类型的不同而改变,但它们确实可以改变细胞形态、影响增殖和转染效率22。此外,LPS还诱导了炎性细胞因子如TNF-α 、IL-1β 、IL-6 、IL-8 和 IL-18的产生,并激活 caspase 4/5/11-NLRP3 非经典炎症小体,最后导致细胞焦亡20, 23。在体内实验,低内毒素浓度可刺激免疫系统,而高浓度可引起发烧、低血压、多器官衰竭,甚至死亡22。


使用生物试剂检测内毒素


细胞比色分析法


HEK-Blue™ LPS Detection Kit 2

• 用途广泛:适用于几乎所有的生物试剂

• 高灵敏度:检测限为 0.01 EU/ml

• 经济实惠:1个试剂盒最多可进行500次测试


试剂盒依赖于InvivoGen专有的HEK-Blue™-4细胞,该细胞稳定表达人源TLR4和一个NF-κB诱导的分泌型胚胎碱性磷酸酶(SEAP)报告基因。简单的实验程序使该试剂盒成为常规测试的理想选择。只要样品中含有微量的LPS,在与HEK-Blue™-4细胞孵育过夜后,会导致NF-κB的激活和SEAP报告基因的表达。培养上清液中的SEAP活性通过加上底物QUANTI-Blue™溶液,并使用分光光度计在620-655nm的波长测量。吸光度与内毒素含量成正比。使用试剂盒中提供的HEK-Blue™内毒素标准品,经系列稀释获得标准曲线从而计算内毒素浓度(大肠杆菌055:B5 LPS 的制备参照FDA批准的内毒素工作标准品(CSE)制备标准)。HEK-Blue™ LPS检测试剂盒2也是InvivoGen内部的常规内毒素检测方法。


LPS检测试剂盒2的原理(见下图)

内毒素污染及检测方法(试剂)


使用此试剂盒的5大原因


1.替代昂贵而耗时的鲎试剂(LAL)。购买此套件一次,冻存HEK-Blue™-4细胞,以后只需重新订购其他耗材。

2.与LAL分析不同,如果样品含有(1,3)-β-D-葡聚糖,使用HEK-Blue™-4细胞进行LPS检测不会导致假阳性。

3.适用于所有生物样品,包括培养基、血清、化学制剂和疫苗佐剂。

4.溶液颜色从粉红色变为紫/蓝色表示阳性反应,结果简单可视。

5.包括一本实验程序小册子,计算内毒素浓度的方法,以及疑难排解部分


相关文献:

— Gray M. A. et al., 2020. Nat Chem Biol. Targeted glycan degradation potentiates the anticancer immune response in vivo. DOI: 10.1038/s41589-020-0622-x.

— Imbert P. R. C. et al., 2021. Curr Biol. An Acquired and Endogenous 

Glycocalyx Forms a Bidirectional “Don’t Eat” and “Don’t Eat Me” Barrier to Phagocytosis. DOI: 10.1016/j.cub.2020.09.082.


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产品名称
产品说明规格货号
HEK-Blue™ LPS Detection Kit 2Assay for the detection and quantification of biologically active LPS1 kitrep-lps2
HEK-Blue™ SelectionAntibiotics for maintenance of HEK-Blue™ cells10 x 1 mlhb-sel
HEK-Blue™ Endotoxin StandardStandardized E. coli 055:B5 LPS10 x 50 EUrep-hbes-10
QUANTI-Blue™ SolutionAlkaline phophatase detection medium (liquid form, 100X) 5 ml

10 ml

rep-qbs

rep-qbs2


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