产品名称：小鼠TNF-α ELISA试剂盒

英文名称：Mouse TNF-α ELISA kit

产品货号：EMC102a

规格：96T/96T*2/96T*5/96T*10

尊敬的客户，感谢您选用本公司 QuantiCyto® ELISA 系列产品。本产品选用世界著名生产厂家的原料，采用专业体外诊断试剂生产技术制造，仅供科研使用。本产品可检测血清、血浆、细胞培养上清液、灌洗液、尿液、羊水、腹水、脑脊液、胸腔积液、组织匀浆液等多种类型样本中天然和重组小鼠 TNF-α浓度，具体适用样本请咨询。使用前请仔细阅读说明书并检查试剂组分。如有疑问，请联系九游会j9网站首页有限公司。Email: tech@qckc0531.com，全国服务热线:4006 800 892。

试剂盒组成：

储存条件：

检测原理:

欣博盛 QuantiCyto® ELISA试剂盒采用双抗体夹心法：抗小鼠TNF-α单抗包被于酶标板上，标本和标准品中的小鼠TNF-α会与单抗结合，游离的成分被洗去。加入生物素化的抗小鼠TNF-α抗体和辣根过氧化物酶标记的亲和素，生物素与亲和素特异性结合；抗小鼠TNF-α抗体与结合在单抗上的小鼠TNF-α结合而形成免疫复合物，游离的成分被洗去。加入显色底物，若反应孔中有小鼠TNF-α，辣根过氧化物酶会使无色的显色剂现蓝色，加终止液变黄。在450 nm处测OD值，小鼠TNF-α浓度与OD450值之间呈正比，可通过绘制标准曲线求出标本中小鼠TNF-α的浓度。

试验所需自备试验器材 (不提供，但可协助购买) :

1. 酶标仪(450 nm波长滤光片)

2. 进口品牌高精度加液器及一次性吸头：0.5-10 ul, 2-20 ul, 20-200ul, 200-1000 ul。

3. 37 ℃恒温箱, 双蒸水或去离子水，坐标纸等。

可协助代购相关产品，请咨询。

QuantiCyto® 双抗体夹心法ELISA原理图：

标本收集:

1. 收集血液的试管应为一次性的无热原，无内毒素试管。

2. 血浆抗凝剂推荐使用EDTA。避免使用溶血，高血脂标本。

3. 标本应清澈透明，悬浮物应离心去除。

4. 标本收集后若不及时检测，请按一次使用量分装，冻存于-20 ℃，-70 ℃电冰箱内，避免反复冻融，3-6月内检测。

5. 如果您的样本中检测物浓度高于标准品最高值，请根据实际情况，做适当倍数稀释(建议做预实验，以确定稀释倍数)。

注意事项:

1. 试剂盒使用前请保存在2-8 ℃。复溶后的标准品若未用完，请废弃。

2. 浓缩生物素化抗体，浓缩酶结合物体积小，运输中颠簸和可能的倒置，会使液体沾到管壁或瓶盖。因此使用前请用手甩几下或1000转/分离心1分钟，以使附着管壁或瓶盖的液体沉积到管底。取用前，请用移液器小心吹打4-5次使溶液混匀。

3. 从冰箱中取出的浓缩洗涤液可能有结晶,属于正常现象，微加热至40℃使结晶完全溶解后再配制洗涤液。（加热温度不要超过50 ℃）使用时洗涤液应为室温。

4. 不同批号的试剂盒组份不能混用（洗涤液和反应终止液除外）。请提前咨询九游会j9网站首页有限公司。

5. 充分轻微混匀对反应结果尤为重要，最好使用微量振荡器(使用最低频率)，如无微量振荡器，可在反应前手工轻轻敲击酶标板框混匀。

6. 在试验中标准品和样本检测时建议作双孔检测。

7. 试验中所用的试管和吸头均为一次性使用，严禁在不同的液体之间混用！否则将影响试验结果。

8. 试验中请穿着试验服并带乳胶手套做好防护工作。特别是检测血液或者其他体液标本时，请按国家生物试验室安全防护条列执行。

9. 如果分次使用，请根据需要量配制各组分，以免配制过多造成浪费而影响后续试验。剩余板孔请用封板胶纸封住，放回铝箔袋中,2个月内用完。

检测前准备工作:

1. 请提前20分钟从冰箱中取出试剂盒，以平衡至室温。

2. 用双蒸水将20×浓缩洗涤液稀释成1×工作液。未用完的放回4 ℃。

3. 标准品: 开盖前1000rpm离心1min。加入标准品&标本通用稀释液0.6ml至冻干标准品中，静置15分钟，待其充分溶解后，轻轻混匀(浓度为2000 pg/ml)。然后根据需要进行稀释。(建议标准曲线使用以下浓度：2000、1000、500、250、125、62.5、31.25、0 pg/ml)。0 pg/ml即空白孔。复溶标准品原液(2000 pg/ml）若未用完的请废弃。

4. 生物素化抗体工作液：按当次试验所需要得用量，使用前20分钟，用生物素化抗体稀释液将30×浓缩生物素化抗体稀释成1×工作液。当日使用。若实验次数过多导致生物素化抗体量不足，可向欣博盛公司单独购买生物素化抗体。（须提供抗体批号）

5. 酶结合物工作液：按当次试验所需要的用量，使用前20分钟，用酶结合物稀释液将30×浓缩酶结合物稀释成1×工作液。当日使用。若实验次数过多导致浓缩酶结合物量不足，可向欣博盛公司单独购买浓缩酶结合物。（须提供酶结合物批号）

标准品稀释方法图例：

以500 ul/管为例，用标准品&标本通用稀释液将复溶后的标准品母液进行倍比稀释，具体稀释方法如下图，也可根据实际用量来稀释，如200 ul/管。

洗涤方法:

1. 自动洗板机：要求注入的洗涤液为350 ul，注入与吸出间隔30－60秒。洗板5次。

2. 手工洗板：甩尽孔内液体，在洁净的吸水纸上拍干，每孔加洗涤液350 ul，静置30秒后甩尽液体，在厚迭吸水纸上拍干。洗板5次。

操作步骤:

1．从已平衡至室温的密封袋中取出试验所需板条，未用的板条和干燥剂请放回铝箔袋内压实自封条，密封口袋，放回4 ℃。

2．空白孔加标准品&标本通用稀释液，其余相应孔中加标本或不同浓度标准品(100 ul/孔)，用封板胶纸封住反应孔，37 ℃恒温箱，避光孵育90分钟。

3．提前20分钟准备生物素化抗体工作液。

4．洗板5次。

5．空白孔加生物素化抗体稀释液，其余孔加入生物素化抗体工作液(100 ul/孔)。用新封板胶纸封住反应孔，37 ℃恒温箱，避光孵育60分钟。

6．提前20分钟准备酶结合物工作液。避光室温(22-25 ℃)放置。

7．洗板5次。

8．空白孔加酶结合物稀释液，其余孔加入酶结合物工作液(100 ul/孔)。用新封板胶纸封住反应孔，37 ℃恒温箱，避光孵育30分钟。

9．打开酶标仪电源，预热仪器，设置好检测程序。

10．洗板5次。

11．加入显色底物(TMB)100 ul/孔，37 ℃恒温箱，避光孵育15分钟。

12．加入反应终止液100 ul/孔, 混匀后即刻测量OD450值(3分钟内)。在仪器保存读数结果并打印一份纸质结果。

13. 实验完毕后将未用完的试剂按规定的保存温度放回电冰箱保存至有效期结束。

建议保存酶标板框，以备下次或者今后试验使用。

结果判断:

1. 每个标准品和标本的OD值应减去空白孔的OD值。

2. 以标准品浓度作横坐标，OD值作纵坐标，手工绘制或用软件绘制并选取最佳拟合曲线，推荐使用二次多项式方程拟合。通过标本的OD值可在标准曲线上查出其浓度。

3. 若标本OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后重测，计算浓度时应乘以稀释倍数。

注意：本图仅供参考，应以同次试验标准品所绘标准曲线计算标本中小鼠TNF-α的含量。

灵敏度、特异性和重复性:

● 灵敏度：最小可测小鼠TNF-α达15.6 pg/ml(8次独立重复实验平均值)。

● 特异性：本试剂盒特异性识别天然和重组小鼠TNF-α。与以下细胞因子等无明显交叉反应。

● 重复性：板内，板间变异系数均<9%。

小鼠 TNF-α简介：

早在三四十年代，人们就发现内毒素能引起小鼠移植肿瘤的出血坏死。1975年，Carswell等人发现卡介苗攻击小鼠后再用内毒素处理，小鼠血清中出现一种能诱导肿瘤组织出血坏死的物质，故命名为肿瘤坏死因子。TNF还称为恶液素(cachectin)，这是因为它能引起急性或慢性感染动物的恶液质状态。TNF-α的生物学活性非常复杂，包括对造血、免疫和炎症的调节；对血管和凝血的影响和对多种器官（肝、心脏、骨、软骨、肌肉和其它组织）的作用等。TNF-α对不同的细胞有不同的作用：杀伤细胞，抑制、促进或不影响细胞生长。TNF-α能诱导敏感细胞凋亡。TNF-α能快速、强烈、不可逆地抑制红细胞系前体(CFU-ET和BFU-E)和红系、粒系肿瘤细胞(K562、HE2、HL-60)的生长，这种抑制作用不需要淋巴细胞或巨噬细胞的辅助，受抑制细胞必须表达TNF-α受体。TNF-α能促进人的成纤维细胞增殖，诱导细胞表达EGFR和转铁蛋白受体，胰岛素和EGF增强TNF-α的这一作用。TNF-α能抑制造血，引起红细胞生成减少、破坏增加。TNF-α也能诱导T细胞表达MHC-Ⅱ类分子和高亲和力IL-2受体。TNF-α能增加组织因子的表达，抑制抗凝蛋白C的辅助因子活性，从而引起血管内皮细胞的前凝血活性。TNF-α能促进骨细胞生长和合成DNA，抑制碱性磷

酸酶活性使骨形成受阻，在骨质吸收和重建中起重要作用。

文献引用：

Chen R, Huang S, Lin T, et al. (2021). Photoacoustic molecular imaging-escorted adipose photodynamic-browning synergy for fighting obesity with virus-like complexes.. Nature Nanotechnology. 

Ding J, Lu G, Nie W, et al. (2021). Self-Activatable Photo-Extracellular Vesicle for Synergistic Trimodal Anticancer Therapy. Advanced Materials. 

Hou B, Zhou L, Wang H, et al. (2020). Engineering Stimuli-Activatable Boolean Logic Prodrug Nanoparticles for Combination Cancer Immunotherapy. Advanced Materials. 

Feng B, H. B., Xu Z, et al. (2019). Self-Amplified Drug Delivery with Light-Inducible Nanocargoes to Enhance Cancer Immunotherapy. Advanced Materials. 

Lou F, Sun Y, Xu Z, et al. (2020). Excessive Polyamine Generation in Keratinocytes Promotes Self-RNA Sensing by Dendritic Cells in Psoriasis. Immunity. 

Zhou F, F. B., Yu H, et al. (2019). Tumor Microenvironment-Activatable Prodrug Vesicles for Nanoenabled Cancer Chemoimmunotherapy Combining Immunogenic Cell Death Induction and CD47 Blockade. Advanced Materials. 

Wang J, Zheng C, Zhai Y, et al. (2021). High-density lipoprotein modulates tumor-associated macrophage for chemoimmunotherapy of hepatocellular carcinoma. Nano Today. 

Zhong D, Xu X, Li Y, et al. (2020). Entirely Synthetic Bacterial Nanomimics for Highly-Effective Tumor Suppression and Immune Elicitation. Nano Today. 

He H, Xu P, Zhang X, et al. (2020). Aging-induced IL27Ra Signaling Impairs Hematopoietic Stem Cells. Blood. 

Hu X, Chen X, Shi X, et al. (2020). Bionanoparticle-Based Delivery in Antihypertensive Vaccine Mediates DC Activation through Lipid-Raft Reorganization. Advanced Functional Materials.

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