很多科研的小伙伴在做免疫组化实验时，可能会遇到一些奇奇怪怪的问题，本篇小欣整理了免疫组化故障排除指南，大家可以根据下列的免疫組化故障排除指南来快速找出问题原因，改善您的实验步骤和解决方案。

首先可以从下面几个情况中找到您的免疫荧光染色的问题所在：

一、染色较弱或无染色

可能存在的问题及解决方案：

一抗量不够：

增加抗体浓度

延长孵育时间

一抗二抗不兼容：

二抗应该是抗一抗宿主的。例如，如果一抗是小鼠来源的，那就需要用抗小鼠的二抗

亚型需要兼容

待测组织干透：

在整个染色过程中都需要使样品完全被覆盖于溶液中。

细胞没有通透：

用甲醇或者丙酮固定可以通透细胞

如果使用甲醛固定，用0.2% Triton X-100通透细胞

脱蜡不充分：

加长切片脱蜡时间

确保使用新鲜配制的二甲苯

一抗不适用：

确保抗体被验证过适用于对应类型的IHC, 福尔马林固定, 石蜡包埋, 新鲜冻存切片等等。

• 使用WB先检测抗体，确保抗体没有变质。

组织过度固定：

减少固定的时间

做抗原修复以显现抗原表位

孵育时间太短：

增加一抗和样品孵育的时间

切片储存问题：

样品染色后应该尽快观察，否则信号会随时间减弱。如需要的话，将切片保存在 4⁰C 黑暗处。

抗体储存问题：

反复冻融是对抗体不利的，可引起降解. 最好是在收到产品时将其分成多个小份来保存。

抗体没有按照建议的方式保存. 如果是这样的话可能需要重新购买一支。

如果二抗没有在黑暗处保存 (使用免疫荧光时), 应更换一支新的二抗。

蛋白没有在检测的组织中出现：

做一个阳性对照

如果目标蛋白显现但是信号不强, 增加一个扩大信号步骤

二、高背景染色

可能存在的问题及解决方案：

脱蜡不充分：

加长切片脱蜡时间

确保使用新制的二甲苯

内源的过氧化物酶活性：

如果使用的是HRP检测系统，在进行染色步骤前用3% H2O2 降低内源过氧化物酶活性

内源的生物素：

如果使用的是生物素检测系统，而样品中内源生物素水平又很高 (例如. 肾脏，肝脏，胰脏)，那么需要先使用抗生物素蛋白孵育样品来封闭内源生物素，再进行正常的封闭步骤，然后在一抗孵育前再用生物素封闭。

抗体浓度太高：

进一步稀释一抗/二抗

非特异性结合：

做一个没有一抗的二抗空白对照.  如果有染色，说明二抗有非特异性结合，更换一种二抗，或者使用标记一抗

封闭不充分：

增加封闭孵育时间或考虑更换封闭液。

信号放大过度：

减少信号放大孵育时间，稀释二抗

洗涤不充分：

步骤之间的适当洗涤非常重要. 确保遵循说明说上的洗涤步骤

组织切片太厚：

考虑使用更薄的切片，因为过厚的切片超过了共焦平面的部分会造成过度的背景染色

三、非特异性染色

抗体浓度过高：

降低抗体的浓度和孵育时间

一抗宿主与要染色的组织来源是同一物种 (例. 小鼠抗小鼠的一抗):

• 尝试使用来自不同物种的一抗。或者尝试用二抗宿主的血清来阻断内源的IgG 。或者用 1% Triton 孵育切片以清理组织。或者使用 TBS-Tween 20作为洗涤液而不是用 PBS-Tween 20。

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