该实验操作指南是将1 型小鼠PFFs (SPR-324) 或1 型人PFFs (SPR-322) 注射到大鼠脑中来产生alpha突触核蛋白病理特征。小鼠PFFs显示出了更强的聚集效果。
使用的动物: 雌性SD (Sprague Dawley) 大鼠
2 uL PFFs 或者单体 (阴性对照) 通过以下两个脑顶叶区的位置注射:
•AP + 1.6, ML + 2.4, DV – 4.2
•AP – 1.4, ML + 0.2, DV – 2.8
30天后, 用生理盐水灌注大鼠然后在大鼠脑冠状平面切开，将中脑与前脑分开。之后两部分都用4% PFA 固定 48 小时.
DAB 操作步骤
材料
•1X TBS (含有和不含有 TX-100的)
•30% H2O2
•柠檬酸缓冲液
•驴血清 (保存在 -20℃; 冻融稳定的)
•一抗: pSYN EP1536Y (Abcam; ab51253)
•二抗: 生物素-SP (long spacer) AffiniPure 驴抗兔 IgG (H+L) (Jackson Immuno; 货号: 711-065-152)
•ABC 试剂 (Vector; 货号: PK-7100)
•DAB 试剂 (Vector; 货号: SK-4100)
•孔板 (规格取决于要染色的区域数量)
•漆刷
•玻璃钩
•漂白剂
•ddH20
•BD Luer-lock 注射器 10 mL
•过滤器 0.22 uM 孔径 (Fisher 货号. SLMP025SS)
•100% EtOH
•Histoclear (用于清理组织)
•显微镜载玻片和盖玻片
•Permount (封片剂)
第一天: (猝灭, 抗原修复, 阻断, 一抗)
-用 1X TBS (震荡, 室温)冲洗切片 5 次以除去冷冻保护剂。
-把切片放到 0.6% H2O2 的 TBS 中，覆盖好，置于操作台20分钟。
*该步骤不要用MESH WELLS*
用 _______ mL TBS, _______ uL 30% H2O2
-用 1X TBS (震荡, 室温) 冲洗切片3次。
-做抗原修复时, 提前在水浴中预热柠檬酸缓冲液至少15~30分钟。在柠檬酸缓冲液中培养切片一小时，将温度设置为37℃，不要震荡 。
-用 1X TBS (震荡, 室温) 冲洗切片3次。
-阻断时, 将切片置于 5% 常规驴血清和0.25% Triton-100的TBS 中阻断 1 小时，冷室、震荡。
*注意: 可以使用含有Triton的TBS阻断液 (1 L TBS, 2.5 mL TX-100), 之后只需要向阻断液中加入驴血清来阻断。*
用 _______ mL TBS,
_______ uL 驴血清, _______ uL 10% TX-100
-用 1X TBS (震荡, 室温) 冲洗切片3次。
-用含 5% 驴血清的 TBS制备一抗溶液，稀释度为1：5000。用锡纸包好切片，和抗体一起在冷室中震荡培养过夜。
用 _______ mL TBS,
_______ uL 驴血清, _______ uL pSYN EP1536Y
第二天: (二抗, ABC 扩大信号, DAB 染色)
-用 1X TBST (震荡，室温) 冲洗切片3次. 余下的步骤中，需要一直将切片保留在锡纸里，即使是冲洗的步骤。
-用含 5% 驴血清的 TBS 制备二抗溶液，稀释度为1：500。在冷室中培锡纸养盖好的切片2小时，震荡。
用 ______mL TBS,
______ uL 驴血清, _______ uL 生物素标记的驴抗兔 IgG
-用 1X TBST (震荡，室温) 冲洗切片3次。
-用 ABC 试剂培养切片 30 分钟 (震荡, 冷室)。
-用 1X TBS 冲洗切片 3 次 (震荡，室温)。
-用 falcon 离心管和 ddH2O制备 DAB 溶液，每 5 mL H2O 加入如下溶液然后涡旋混合:
2 滴缓冲溶液
4 滴 DAB 溶液
2 滴双氧水溶液
*注意: 所有接触过DAB的器具只能用来操作DAB。我们还在通风橱内准备了一个DAB专用的废液缸。使用玻璃钩来处理DAB溶液中的切片而不能用漆刷，并且操作后要用漂白剂冲洗玻璃钩。盛装过DAB的器皿都需要用漂白剂冲洗并且处理到生物性危害箱中。*
-用注射器过滤到新的6孔板中。每一个需要染色的脑切片都用一个新的DAB孔。
-在DAB中培养每个切片直到变为浅棕色 (2-3 分钟就足够; 时间太长可能会造成背景染色太多)
-用 ddH2O 冲洗 3 次
-在 1X TBS 中封片，然后在切片柜中干燥过夜。
第三天: (脱水和盖玻片)
*注意: 在开始脱水步骤之前，确保浸片用的玻璃皿里有足够的液体可以盖过切片上的所有组织。*
-按照如下顺序和时间脱水切片：
1. 30 秒 ddH20
2. 3 分钟 70% EtOH
3. 3 分钟 95% EtOH
4. 3 分钟 95% EtOH
5. 3 分钟 100% EtOH
6. 3 分钟 100% EtOH
*置于振荡器*
7. 5 分钟 Histoclear
8. 5 分钟 Histoclear
9. 5 分钟 Histoclear
-将切片从切片篮从取出，一次一片，置于吸水纸上。
-加封片剂时，取一个P1000 移液器和吸头，将吸头尖剪掉，容量设到400到500 μL.
-连续滴几滴封片剂 Permount 到切片的中间，倾斜切片使封片剂完全覆盖切片。
-用棉棒的木头一端赶出切片中的气泡。
-将切片放在吸水纸上，置于操作台上过夜晾干。
*注意: ~24 小时之后, 多余的Permount 封片剂应该用Histoclear移除*
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