九游会j9网站首页,j9九游会首页登录,j9九游会ag真人官网

    您好,欢迎光临九游会j9网站首页商城!
    服务热线:400 680 0892
    新闻资讯 News

    蛋白质印迹(Western Blot)保姆级教程 Part 2:解决WB的疑难杂症

    2024-08-06
    浏览次数: 32

    背景有黑点,怎么办?详情信息

    1、封闭液未溶完全
    解决:
    A.确认BSA/牛奶有完全溶解,建议增加溶解时间或溶解后取上清液使用。
    B.利用0.45um滤纸过滤溶液,也可使用商品化试剂,如GTX30964(Trident Universal Protein Blocking Reagent,适用于WB、IHC、ICC/IF、ELISA)。

    C.改变缓冲液,如换为BSA。


    2、溶液污染
    解决:

    使用现配的溶液(Running/transfer/blocking/wash buffers)或商业化溶液减少因长菌长霉造成的黑点。


    3、封闭液及抗体交互作用

    解决:
    一般脱脂牛奶中含有casein这种磷酸蛋白,可能会与磷酸化抗体产生非特异性结合。因此,如使用磷酸化抗体,建议用BSA作为封闭溶液,同时洗脱溶液也用TBST,如此可降低黑点高背景的情况。


    过曝,怎么办?详情信息
    1、蛋白样品过量
    解决:

    降低蛋白上样量,通常蛋白上样量为30-50ug,但有些蛋白表达量较高(如β-actin),此时可依蛋白表达量,进行微调。


    2、抗体过量
    解决:
    A.增加抗体稀释倍数。
    B.减少孵育时间,一般孵育时间为37℃,1小时。

    C.于4℃过夜孵育,减少抗体非特异性结合。


    3、讯号过曝
    解决:
    A.缩短曝光时间。
    B.使用低灵敏的ECL。


    拖带,怎么办?详情信息
    1、样品不纯,有杂质污染
    解决:
    A.重新离心样品,取上清液使用。
    B.使用较纯的试剂配制细胞裂解液或购买商业化产品。
    C.使用Benzonase®核酸酶,Benzonase®核酸酶能迅速水解核酸,降低蛋白样品粘度,减少核酸对跑胶的干扰。

    D.全细胞或亚细胞萃取,使用商业化全细胞或亚细胞萃取试剂盒提取蛋白样品,减少配制试剂溶液以及操作中分离不干净的问题。


    2、蛋白样品过量
    解决:
    A.降低蛋白上样量,通常蛋白上样量为30-50ug,但有些蛋白表达量较高(如beta actin),此时可依蛋白表达量,进行微调。

    B.蛋白变性不完全,也会使条带成团拖曳;此时,可通过延长样品加热时间(一般约5分钟)及调整SDS(一般是2 %)比例,使蛋白变性更完全。


    3、讯号过曝
    解决:
    A.缩短曝光时间。
    B.使用低灵敏的ECL。


    条带扭曲,怎么办?详情信息
    1、胶没配好
    解决:
    A.确保APS&TEMED正常,并新鲜配制胶体。

    B.空的泳道加Sample Buffer


    2、电流电压问题
    解决:

    避免胶体过热。电压过高也会出现微笑、歪斜条带等条带,建议上层浓缩胶使用80V;下层分离胶使用100-120V。另外也需检查电泳槽是否有锈蚀造成电流不稳。过热时可改为在冷室或者冰浴中进行电泳。


    3、转膜问题
    解决:
    小心滚压胶体并确保与膜贴合,有时出现 2个条带是因为转膜时不小心移动到膜产生叠影。


    高背景,怎么办?详情信息
    1、封闭问题
    解决:
    A.确认封闭完全。封闭作用不足,这是其中一种可能的原因,提高封闭物浓度可确保封闭液完全覆盖转印膜,如使用5% 脱脂奶粉或BSA。
    B.封闭液不与抗体反应。这种情况较常发生在磷酸化抗体的使用过程中,由于牛奶含有casein这种磷酸蛋白,因此如果使用牛奶当封闭液,封闭液与磷酸化抗体可能会产生非特异性的结合。这个情况下,建议使用BSA作为封闭液,同时搭配使用TBST的洗脱液来帮助降低高背景值的状况。

    C.封闭时间增加,一般情况会使用室温37度封闭1小时,可视情况调整封闭的条件。


    2、膜的问题
    解决:
    A.选择合适的膜(可参考详情信息)
    B.膜干掉,建议整个实验过程都须注意让膜保持湿润,特别是PVDF膜。

    C.膜没有完全均匀湿透,PVDF膜较会出现这个状况,使用PVDF膜前,需用100% methanol完全浸润膜。


    3、抗体问题
    解决:
    A.降低抗体浓度
    B.以阳性对照确认二抗

    C.足够的洗脱时间和次数


    4、呈色问题
    解决:
    ECL呈色问题造成高背景值的原因,可能是因为化学显色底物过多;建议按说明书加入适量的显色底物。


    非特异性条带,怎么办?详情信息
    1、蛋白降解
    解决:
    A.加蛋白酶抑制剂或磷酸酶抑制剂,避免蛋白降解。
    B.冰上操作。

    C.避免反复冻融样品(建议分装);建议使用新鲜制备的样品。


    2、蛋白形成多聚体

    解决:
    A.使用现配的DTT/2-ME并将加热时间延长,帮助打断多聚体的双硫键。

    B.样本煮沸温度达到95℃-100℃。


    3、确认蛋白特性
    解决:

    查询生物信息是否有后修饰、剪切体等。


    4、抗体浓度过高/蛋白样品过量
    解决:
    A.增加抗体稀释倍数,也可调整孵育时间,并在4℃孵育。

    B.减少上样量。


    5、抗体非特异性结合
    解决:
    A.增加洗膜次数与时间或在洗涤液里改用不同强度的detergent或是增加浓度。

    B.设对照组来确认抗体非专一性结合可能的原因,例如:是否有目标蛋白表达。


    6、抗体检测到heavy/light chain的信号
    解决:
    这种情况通常发生在IP实验里,GeneTex有一系列可避免辨认heavy/light chain的特制二抗,其设计原理是用来辨认native的一抗结构。(可参考详情信息)



    六码一抗 不分包装 全面EXTRA 5% OFF

    详情请咨询 GeneTex 全国独家代理-九游会j9网站首页 

    全国服务热线: 4006-800-892       邮箱: market@qckc0531.com 

    深圳: 0755-26755892         北京: 010-88594029         上海: 021-34613729           

    广州: 020-87615159           香港: 852-69410778 

    代理品牌网站: www.qckc0531.com 

    自主品牌网站: www.neobiosescience.net

    分享到:
    关注欣博盛公众号
    Copyright ©2021 - 2023 深圳九游会j9网站首页有限公司
      网站地图
    犀牛云提供企业云服务
    九游会j9网站首页