Atlas新品强势来袭——MolBoolean™检测试剂盒

使用传统方法研究细胞或组织中蛋白质与蛋白质之间的相互作用（PPIs）经常会得到假阳性或假阴性的结果。原位邻接法（PLA）的出现使细胞和组织中内源性蛋白质相互作用的检测成为可能，但这一方法仍然无法确定游离蛋白(非相互作用蛋白)的具体情况。

细胞和组织中蛋白质与蛋白质之间相互作用的动态机制在很大程度上取决于两个蛋白质的空间位置，并与其表达的丰度也有很大关系。因此，在邻近蛋白相互作用的研究中，不仅要了解相互作用蛋白的数量，还需要了解游离蛋白的情况，这一点至关重要。

Atlas Antibodies公司与来自Uppsala大学的Ola Söderberg教授合作，共同开发了一款基于邻位连接技术、快速同时检测两个靶标蛋白游离部分和相互作用部分的MolBoolean™检测试剂盒。

MolBoolean™利用近距离探针进行双目的靶标的识别，并生成Rolling circle products (RCPs)扩增产物以产生荧光信号，这一方法可以实现低含量蛋白质的检测。此外，通过进行一系列的分子学操作步骤，利用一个或两个独立的荧光检测报告检测系统可成功区分出扩增产物是由单个蛋白质还是由相互作用的蛋白质产生。

MolBoolean™产品介绍

MolBoolean™ Mouse/Rabbit（货号：MolB00001）利用其专有的寡核苷酸技术，可同时检测两种相关蛋白（蛋白 A、蛋白 B 和相互作用蛋白 AB）的游离状态和相互作用(在~40 nm的接近范围内)的部分。

MolBoolean™ Mouse/Rabbit Kit依靠两个邻近探针与抗小鼠和抗兔二抗结合，并通过Rolling circle amplification(RCA)来放大信号。该系统采用两种不同的免疫荧光检测体系，其最大发射波长为 590 nm（ATTO565，TxRed 滤光片）和 664 nm（ATTO647N，Y5 滤光片）。

MolBoolean™试剂盒组成

MolBoolean™ Mouse/Rabbit 试剂盒可用于固定细胞和FFPE 组织样本中MolBoolean 分析。试剂盒规格为4.8mL，可完成约120Tests的细胞检测(40ul/Test)和60Tests组织检测(80ul/Test）

MolBoolean™ 试剂盒共包含如下15个组分：

1:Blocker (4x); 2:Diluent (1x); 3:Probe A (80x); 4:Probe B (80x); 5:Circle (40x); 6:Additive (40x); 7:Buffer A (10x); 8:Nickase enzyme (80x); 9:Buffer B (8x); 10:Tag oligos (40x); 11:Ligase enzyme (80x); 12:Polymerase enzyme (40x); 13:Buffer C (5x); 14:Detection oligos (40x); 15:Buffer D (10x).

MolBoolean™的优势

●通过同时检测游离蛋白和相互作用蛋白,可实现完整的空间定量分析;

● 通过将蛋白相互作用数据转换为目标蛋白的总表达水平，实现精确定量；

● 无需工程化的蛋白表达，即可获得生物相关数据；

● 通过Rolling Circle扩增技术将荧光信号提高1000倍，从而准确实现对低含量蛋白质的检测和定量；

● 适应于不同的研究需求；

● 产品为通用型，可与实验中任意的一抗搭配使用；

● 经细胞和组织应用验证。

MolBoolean™试剂盒操作步骤

利用MolBoolean™试剂盒检测相关蛋白之间是否存在相互作用，需要以下七个步骤 ：

Step1：邻位连接探针与一抗结合；

Step2：邻位连接探针臂（Arm）与环状DNA寡核苷酸杂交；

Step 3：DNA缺刻（DNA Nicking）；

Step4：标签寡核苷酸掺入；

Step 5：DNA 连接；

Step 6：核苷酸环扩增；

Step 7：检测。MolBoolean™应用举例

应用一： MCF-7细胞中，使用MolBooleanTM试剂盒对E-cadherin/β-catenin进行染色	应用二： MCF-7细胞中，使用MolBooleanTM试剂盒对EMD/LMNB1进行染色
左图为利用MolBoolean™分析检测了MCF-7细胞中E-cadherin(品红色)和β-catenin(绿色)之间的相互作用。实验中使用的一抗均为来自Atlas Antibodies厂家的:Anti-CDH1(Cat#AMAb90862)和Anti-CTNNB1 (Cat#HPA029159)。  图像结果显示了游离蛋白与相互作用蛋白的相对定量: 在1个或2个荧光通道中检测到的RCPs产物:32%游离的E-cadherin、19%游离的β-catenin和49% E-cadherin/β-catenin复合物。 检测数据统一转换为总目标蛋白水平(总 RCPs）。	左图为利用MolBoolean™分析检测了MCF-7细胞中EMD(品红色)和LMNB1 (绿色)之间的相互作用。实验中使用的一抗均为来自Atlas Antibodies厂家的: Anti-EMD(Cat#AMAb90562)和Anti-LMNB1(Cat#HPA050524)。                                通过分别检测1个或2个荧光通道中检测到的RCPs产物，显示游离蛋白与相互作用蛋白的相对定量。
应用三： 人肾脏组织中，使用MolBooleanTM试剂盒对ACE2/TMPRSS2进行染色	应用四： 人结肠组织中，使用MolBooleanTM试剂盒对SATB2/HDAC1进行染色
左图为利用MolBoolean™分析检测了人肾脏组织中ACE2(品红色)和TMPRSS2(绿色)之间的相互作用。实验中使用的一抗均为来自Atlas Antibodies厂家的:Anti-ACE2(Cat#AMAb91259)和Anti-HDAC1(Cat#HPA035787)。       图像结果显示了游离蛋白与相互作用蛋白的相对定量。在1个或2个荧光通道中检测到的RCPs产物: 51%游离的ACE、17%游离的TMP和32% ACE/TMPRSS2复合物。 检测数据统一转换为总目标蛋白水平(总 RCPs)。	左图为利用MolBoolean™分析检测了SATB2(品红色)和 HDAC1(绿色)之间的相互作用。实验中使用的一抗均为来自Atlas Antibodies厂家的Anti-SATB2(Cat# AMAb90682)和Anti-HDAC1(Cat# HPA029693)。       图像结果显示了游离蛋白与相互作用蛋白之间的空间位置。

参考文献：

Kotliar et al. (2023) Expanding the GPCRRAMP interactome. bioRxiv [Preprint]. 2023 Nov 23:2023.11.22.568247. PMID: 38045268;

Raykova et al. (2022) A method for Boolean analysis of protein interactions at a molecular level. Nat Commun. 2022 Aug 13;13(1):4755. Erratum in: Nat Commun. 2023 Sep 6;14(1):5450. PMID: 35963857

Rivas-Santisteban et al. (2023) Boolean analysis shows a high proportion of dopamine D2 receptors interacting with adenosine A2A receptors in striatal medium spiny neurons of mouse and non-human primate models of Parkinson’s disease. Neurobiol Dis. 2023 Nov;188:106341. PMID: 37918757

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